線粒體檸檬酸（Mitochondrion citric acid, MCA）含量試劑盒說明書

分光光度法

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

CA 是線粒體三羧酸循環的第一個中間產物，由檸檬酸合酶催化乙酰CoA 與草酰乙酸合成，其含量是三羧酸循環強度的主要指標之一。配合測定丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性、乙酰 CoA 含量、檸檬酸合酶活性和 CA 含量，其中（1）丙酮酸含量和丙酮酸脫氫酶活性變化可以反映糖酵解進行程度，（2）綜合分析丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性和乙酰CoA 含量變化可以反映脂肪酸β-氧化途徑提供的乙酰 CoA 情況，（3）乙酰CoA 含量、檸檬酸合酶活性和CA 含量變化可以反映三羧酸循環進行狀況。

測定原理：

CA 在檸檬酸裂解酶的作用下，生成α-酮酸（草酰乙酸）；在弱酸性條件下，α-酮酸進一步與苯肼反應，生成相應的α-酮酸苯腙；α-酮酸苯腙在 330nm 處有吸收峰，該波長下吸光度的變化程度可反映出 CA 的含量。

線粒體檸檬酸含量試劑盒   三羧酸循環系列

組成：

BK6009-25T/24S：

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 7.5ml 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑 4℃保存；標準品：液體 1ml×1 支，10μmol/ml 檸檬酸標準液，4℃保存。

BK6009-50T/48S：

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 15ml 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑 4℃保存。標準品：液體 1ml×1 支，10μmol/ml 檸檬酸標準液，4℃保存。

具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準

自備儀器和用品：

分光光度計、水浴鍋、可調式移液槍、1ml 石英比色皿、研缽和蒸餾水。

線粒體中檸檬酸提取：

稱 0.05~0.1g 樣品（建議稱 0.1g 樣本），加入 0.5ml 酸性提取液，冰上充分研磨，600g/min 4℃離心 5min；取上清至另一EP 管中，11000g/min 4℃離心 10min，棄上清（取 300μl 該上清液和 300μl 堿性提取液中和后可用于細胞質CA 含量測定）；沉淀即線粒體，向沉淀中加入 0.5ml 酸性提取液，充分懸浮溶解，超聲波破碎（功率 20％，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復 30 次），取此溶液 300μl 和 300μl 堿性提取液中和，混勻，置冰上待測（不可用于蛋白質含量測定）。

測定步驟：

1、分光光度計預熱 30 min 以上，調節波長到 330nm，蒸餾水調零。

2、試劑一、二和三 37℃預熱 10min。

3、樣本測定：

空白管和標準管通常只需要各做一個。

充分混勻，330nm 立即測定初始吸光值A1 和 37℃孵育 30min 后的吸光值A2，ΔA=A2 –A1。

檸檬酸含量計算：

（1） 按蛋白濃度計算

檸檬酸含量(μmol/mg prot)=[C 標準管×(ΔA 測定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標準管－ΔA 空白管) ×V 樣]÷（V 樣÷Cpr）=10×(ΔA 測定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標準管－ΔA 空白管)÷Cpr蛋白質含量需要另外測定。

（2） 按樣本鮮重計算

檸檬酸含量(μ mol/g 鮮重)=[C 標準管×(ΔA 測定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標準管－ΔA 空白管) ×V 樣]÷（W×V樣÷V 樣總）=10×(ΔA 測定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標準管－ΔA 空白管)÷W

C 標準管：標準液濃度，10μmol/ml； V 樣：加入反應體系中樣本體積，0.3ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣品蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質量，g。注意：zui低檢測限為 10nmol/mg prot 或 1μmol/g 鮮重。

線粒體檸檬酸含量試劑盒   三羧酸循環系列